黑色素瘤細胞株被定義為經(jīng)原代培養(yǎng)的組織細胞,培養(yǎng)到第10代左右,度過*次死亡危機后的細胞群,這種細胞的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變;細胞系則被定義為可以度過第二次死亡危機,傳代培養(yǎng)到40~50代的細胞,這部分細胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了部分改變并且細胞帶有癌變的特點,這種細胞在適宜條件下無限傳代。
產(chǎn)品目錄或者細胞說明書上的推薦的培養(yǎng)基一般是黑色素瘤細胞株的原始提供者推薦的培養(yǎng)基或者已經(jīng)經(jīng)過驗證的對該黑色素瘤細胞株zui合適的培養(yǎng)基,細胞對未推薦的培養(yǎng)基也許會適應(yīng),也有可能不適應(yīng)。對于更換培養(yǎng)基,應(yīng)謹慎對待,更換培養(yǎng)基時,應(yīng)留一瓶細胞使用推薦的培養(yǎng)基培養(yǎng),留作種子。黑色素瘤細胞株更換培養(yǎng)基有兩種方法,zui簡單的方法是直接更換培養(yǎng)基,強制使細胞適應(yīng)新的培養(yǎng)基;還有一種更溫和的方法:傳代細胞的時候分成細胞兩瓶,*瓶使用原來推薦的培養(yǎng)基,第二瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基,50%新的培養(yǎng)基,之后仔細觀察細胞的生長狀態(tài),如果第二瓶細胞生長狀態(tài)不好,應(yīng)立即停止更換培養(yǎng)基,如果第二瓶生長狀態(tài)好,黑色素瘤細胞株可以繼續(xù)傳代分瓶,一瓶使用50%原來推薦的培養(yǎng)基,50%新的培養(yǎng)基,另一瓶使用25%原來推薦的培養(yǎng)基,75%新的培養(yǎng)基,繼續(xù)觀察,如果細胞狀態(tài)好,可以全部換成新鮮的培養(yǎng)基。
黑色素瘤細胞株的污染鑒定、預(yù)防和處理問題。普通微生物污染:培養(yǎng)基渾濁,高倍鏡觀察有微生物污染;按規(guī)定棄用并全面嚴格滅菌。支原體污染:顯微鏡無法觀察,依經(jīng)驗表現(xiàn)為細胞生長緩慢,有細胞漂浮等等,應(yīng)通過PCR 等方法鑒定,如發(fā)現(xiàn)支原體污染,應(yīng)按規(guī)定棄用,實驗室要及時全面消毒滅菌,防止蔓延。(有些常規(guī)性細胞學實驗不受支原體污染影響,可以繼續(xù)使用細胞傳代,為防污染擴大蔓延,可以選擇性的在培養(yǎng)基中加入價的其它種抗生素,并在隔離實驗室操作和獨立使用一切用具與培養(yǎng)基等)。
胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,已基本上飽和,為使細胞能繼續(xù)生長,同時也將細胞數(shù)量擴大,就必須進行傳代(再培養(yǎng))。黑色素瘤細胞株傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經(jīng)過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以,而貼壁細胞需經(jīng)消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶(比如胰蛋白酶)消化貼壁細胞成單個細胞,也可加入乙二胺四乙酸(EDTA)提高消化能力,EDTA 是一種二價離子的螯合劑,能抑制細胞膜上的Ca2+和Mg2+。常用的細胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA,一般用不含Ca2+和Mg2+的鹽溶液配置,先用胰酶-EDTA 消化液清洗細胞(5.0 -10.0 ml/75cm),然后棄去消化液,重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask) ,觀察黑色素瘤細胞株直到細胞變圓脫離瓶壁,此過程一般需要5-15分鐘,為了避免細胞成團,消化細胞的過程中不要拍打細胞瓶。對于特別難消化的細胞,可以加入胰酶EDTA 消化液后把細胞置于37°C 促進消化,細胞脫離瓶壁后,立刻加入含有血清的*培養(yǎng)基中止消化,血清中某些蛋白質(zhì)能夠抑制胰酶的活性。一般情況下,離心并不需要。如果細胞需要無血清或者低血清的培養(yǎng)基,可以以125000g 轉(zhuǎn)速離心5分鐘,然后棄去中止用的培養(yǎng)基,加入適合的新的培養(yǎng)基輕輕混勻細胞,移入到新的培養(yǎng)瓶。傳代的比例視細胞類型而定,一般是1:2-1:20,黑色素瘤細胞株具體比例可參考說明書。胰蛋白酶會對某些細胞的細胞膜產(chǎn)生損傷,對于這種類型的細胞,可用細胞刮輕輕刮下細胞,加入適量的培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻細胞,然后進行傳代培養(yǎng)。